Transmisja pourodzeniowa wirusa niedoboru odporności typu 1 z matki na niemowlę – prospektywne badanie kohortowe w Kigali w Rwandzie ad

Zestandaryzowany kwestionariusz był podawany na ślepo kobietom, które serokonwersji i kontroli w celu zidentyfikowania potencjalnych czynników ryzyka serokonwersji u matek i po urodzeniu nabycie HIV-1 u ich niemowląt. Metody serologiczne i immunologiczne
W momencie porodu, 10 ml krwi uzyskano od matki i pępowiny w celu wykrycia przeciwciał HIV-1. Wszystkie próbki surowicy badano przesiewowo za pomocą komercyjnego testu immunoenzymatycznego (Vironostika, Organon Teknika, Boxtel, Holandia). Gdy próbki surowicy były pozytywne w teście immunoenzymatycznym, wyniki potwierdzono za pomocą komercyjnej techniki Western blot (Du Pont de Nemours, Wilmington, Del.), W której reakcję zdefiniowano jako pozytywną, gdy wykazywały co najmniej trzy prążki, po jednym z każdego genu -product group: gag, pol i env. 5 Podczas każdej trzymiesięcznej wizyty w szpitalu, 5 ml krwi pobierano od matek i niemowląt do testu immunoenzymatycznego HIV-1. W przypadku serokonwersji, Western blotting przeprowadzono retrospektywnie na wszystkich przechowywanych próbkach od matki i niemowlęcia i prospektywnie na każdej próbce, niezależnie od wyników następnego testu immunoenzymatycznego. Próbkę krwi pobrano od matki dwa tygodnie po porodzie. Podpopulacje komórek jednojądrzastych oznaczano ilościowo techniką pośredniej immunofluorescencji i przeciwciałami monoklonalnymi: OKT4 dla pomocniczych limfocytów T (T4) i OKT8 dla supresorowo-cytotoksycznych komórek T (T8) (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ). Stosunek T4 / T8 poniżej uznano za kryterium upośledzonej odporności komórkowej.6
PCR
Pięć do 10 ml krwi pępowinowej i, jeśli to możliwe, krew pobraną od niemowląt podczas każdej trzymiesięcznej wizyty zebrano do EDTA (10 procent). Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej rozdzielono na 5,6% gradientu Ficoll i 9,6% metrizoanu sodu (Lymphoprep, Nycomed AS, Oslo, Norwegia). Komórki przemyto dwukrotnie roztworem Coona zawierającym 1% albuminy bydlęcej w surowicy, a peletki komórek przechowywano w -70 ° C. DNA z peletek ekstrahowano w buforze do lizy (10 mM TRIS, 5 M chlorek sodu i 0,5 M EDTA) zawierającym 0,5 procent sarkozylu i 0,2 mg proteinazy K na mililitr, a następnie ekstrahowano fenolem (dwukrotnie) i chloroformem (jeden raz) przed wytrąceniem w absolutnym etanolu i bezpośrednim pobraniu DNA za pomocą pipety Pasteura. Po ponownym zawieszeniu w wodzie destylowanej, DNA oznaczono ilościowo za pomocą absorpcji światła 260 nm i stosowano do PCR.
Tabela 1. Tabela 1. Sekwencje i lokalizacje starterów oligonukleotydowych w genomie wirusa HIV-1 * Przeprowadzono podwójną reakcję PCR7 z trzema parami starterów oligonukleotydowych specyficznych dla HIV-1 (Eurogentec, Liege, Belgia). Zamplifikowane sekwencje znajdowały się w regionach gag, pol i env genomu HIV-1 (tabela 1). Wszystkie testy PCR zostały wykonane w dwóch egzemplarzach w Rwandzie i potwierdzone na Uniwersytecie w Liege w Belgii. W pierwszej amplifikacji .g docelowego DNA zmieszano z 50 .l buforu reakcyjnego (100 mM TRIS kwas solny [pH 8,3], 500 mM chlorek potasu i 1,5 mM chlorek magnezu), 200 .M każdego trifosforanu deoksynukleozydu (ATP, CTP, TTP i GTP), 2 U polimerazy Taq (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.) Na 50 . i .M starterów
[przypisy: olx wagrowiec, tantum verde ulotka, dentysta na nfz kraków ]